Forsiden

Emnekatalogen

Søk

Sjanger

Analyse/tolkning (709) Anmeldelse (bok, film...) (634) Artikkel (927) Biografi (262) Dikt (1036) Essay (552) Eventyr (115) Faktaoppgave (374) Fortelling (833) Kåseri (610) Leserinnlegg (119) Novelle (1310) Rapport (621) Referat (173) Resonnerende (204) Sammendrag av pensum (179) Særemne (155) Særoppgave (337) Temaoppgave (1246) Annet (527)

Språk

Bokmål (8054) Engelsk (1612) Fransk (26) Nynorsk (1123) Spansk (11) Tysk (38) Annet (59)
Meny

Du er her: Skole > Kutting og kategorisering av lambda-DNA med restriksjonsenzymer og elektroforese

Kutting og kategorisering av lambda-DNA med restriksjonsenzymer og elektroforese

Det desidert viktigste 3BI-forsøket noen gang. Tror man skal kunne utføre deler av dette til eksamen.

Sjanger
Rapport
Språkform
Bokmål
Lastet opp
05.09.2006


Utstyr:

- Mikropipette, 5-100 mikroliter med flere spisser

- Begerglass

- Restriksjonsenzymer:

  · EcoRI(i rød beholder)

  · BamHI(i blå beholder)

  · HindIII(i grønn beholder)

- Lambda-DNA(fra influensa, ekstrahert vha. bakterier)

- Destillert vann

- Mikrosentrifugerør med lokk

- 6 Fargede mikrosentrifugerør, henholdsvis 2 røde, 2 blå, 2 grønne

- Fargetusj i sistnevnte farger

- Elektroforesekar

- Bufferløsning

- Strømkilde(9V batteri)

- Varmeskap m/ vannbad

- Karbonfiber

- Klipetenger

- Saks

- Markørfarge

- Hansker

 

Vi gjorde:

Alle steg beskrevet her ble gjentatt to ganger i fall feil skulle oppstå.

 

1)    Vi tilsatte 20 mikroliter destillert vann til rørene som inneholdt lambda-DNAet ved hjelp av pipetten. Vi ristet så forsiktig på rørene til det blå DNAet var løst tilnærmet homogent i vannet i ca. ett minutt. Vi lot så rørene stå i omtrent 5 minutter.


 

2)    Etter dette blandet vi de ulike enzymene med den nå vannløste DNA-prøven. Ved å bruke mikropipetten tilsatte vi 20 mikroliter lambda-DNA til henholdsvis et blått, rødt og grønt rør. Vi tilsatte også 20 mikroliter lambda-DNA til et enzymfritt rør. Vi fargela så lokket på seks av våre egne rør; to blå, to røde og to grønne for å overføre de ulike DNA-løsningene med samme fargekode til dem. Vi tok dessuten et syvende rør som vi ikke fargela. Vi brukte våre egne rør som var noe større enn de medfølgende, fargede sentrifugerørene av praktiske årsaker. Vi lot så rørene stå i omtrent fem minutter slik at de tørkede enzymene skulle få løse seg opp. I tillegg ristet vi forsiktig på rørene i ca. et minutt.

 

Vi passet på å bytte spiss på mikropipetten hver gang vi brukte den for å unngå uønsket forurensing av prøvene.

 

3)    Etter å ha klargjort prøvene, satte vi rørene ned i en isoporplate for så å plassere platen i et oppvarmet vannbad. Her lot vi rørene stå i 45 minutter for at enzymene skulle virke. Årsaken til at vi plasserte disse varmt i 45 min er at enzymene fungerer raskere ved økt temperatur. Etter å ha gjort dette, tilsatte vi 2 mikroliter markørfarge til samtlige prøver og blandet dette godt. Dette gjorde vi for å kunne observere selve ektroforesen tydeligere senere.

 

4)    Vi tok nå fram elektroforesekaret. Gelen i dette var en forhåndslaget løsning laget dagen før ved å varme opp 1g agarose i 100 mL TBE-buffer(svakt basisk). Vi tilsatte så en del flytende TBE-buffer i karet.

 

5)    Deretter klipte vi ut to biter av karbonfiberen og plasserte dem på innsiden av de smale kantene av karet som illustrert under(ved +/- elektrodene)

 

<bilde>

 

Det utklipte karbonfiberet fungerte altså som elektroder, der den negative polen utgjøres av de negative fosfationene i DNA-et, mens den positive er utgjort av

karbonkationer.

 

6)    Vi kunne nå applisere prøvene på gelen. Dette gjorde vi ved å bruke mikropipetten. Ved å kun trykke mikropipetten ned til første hakk oppnådde vi å påføre de ulike enyzmløste DNA-løsningene forsiktig ned i brønnene. Fordi vi tidligere hadde fargemarkert de ulike enzymene kunne vi nå skille mellom dem, og altså ha oversikt over hvilket enzym som virket i hvilken brønn. Vi noterte oss derfor i hvilken brønn vi overførte de ulike fargenemarkerte løsningene.

 

7)    Nå kunne vi koble til strømkilden. Dette gjorde vi som vist på figuren over ved å feste jerntenger festet til en ledning på hver av karbonelektrodene. Vi slo så på strømkilden og ventet på at DNA-bitene i de ulike brønnene skulle spre seg i ulik grad fra den negative til den positive elektroden. Fordi DNA-bitene var av ulik størrelse, møtte de ulik friksjon i gelen, og man kunne derfor se en tydelig strekmessig oppdeling av DNAet fra plusspolen til minuspolen. Årsaken til at bitene trekkes mot plusspolen er at DNA inneholder negative fosfatgrupper som for eksempel PO4-. Vi lot strømmen stå på helt til den blå markør-fargen i de ulike bitene nærmet seg plusspolen. Dette tok flere timer.

Legg inn din oppgave!

Vi setter veldig stor pris på om dere gir en tekst til denne siden, uansett sjanger eller språk. Alt fra større prosjekter til små tekster. Bare slik kan skolesiden bli bedre!

Last opp stil